Estudos têm demonstrado que o exercício físico intenso provoca estresse oxidativo em animais e humanos, estando possivelmente relacionado, por exemplo, com fadiga e lesões teciduais.
Por outro lado, poucos estudos relatam a sua ocorrência em atletas sob treinamento intenso, principalmente devido a problemas metodológicos.
O presente estudo teve como objetivo, portanto, estudar em atletas a possível ocorrência de lesões oxidativas em lipídeos em decorrência do exercício físico ou do treinamento através da quantificação da quimioluminescência urinária e malondialdeído (MDA) plasmático.
Os exercícios utilizados foram: a) corrida na esteira rolante (25-30min), com a quantificação de ambos os parâmetros e da capacidade antioxidante plasmática total; b) corrida de 20km realizada por maratonistas; c) treinamento intervalado intenso realizado por corredores de 400m rasos; d) jogo de futebol com 50min de duração; e e) treinamento de força/musculação com e sem suplementação com creatina.
Nos quatro últimos itens, somente a quimioluminescência urinária foi avaliada.
As condições em que se notou elevação significativa na quimioluminescência urinária após a realização do exercício são:
a) corrida de 20km;
b) jogo de futebol; e
c) treinamento de força/musculação sem suplementação com creatina.
A corrida na esteira promoveu aumento na concentração plasmática de MDA durante e após a sua realização; a capacidade antioxidante plasmática total modificou-se de forma inversamente proporcional ao aumento no MDA.
Os exercícios praticados pelos atletas neste trabalho provocaram estresse oxidativo de maneira diferente, estando possivelmente relacionado com a duração e a intensidade dos mesmos, e não somente com a intensidade.
Neste trabalho também se constatou que o consumo de creatina associado ao treinamento de força/musculação pode atuar como antioxidante.
Estudos sobre estresse oxidativo realizados com animais experimentais e seres humanos demonstraram que o aumento na atividade metabólica favorece a ocorrência de lesões oxidativas em biomoléculas.
Como o treinamento esportivo e a competição elevam acentuadamente a atividade metabólica celular, essas lesões podem assumir dimensões ainda maiores nessas condições.
Estresse oxidativo envolve aumento na formação de ânion superóxido (O2 •-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (HO•), dentre outros, genericamente denominados de espécies reativas de O2 (EROs), em detrimento das defesas antioxidantes químicas e enzimáticas disponíveis(8).
Existem evidências de que o óxido nítrico (NO·) e derivados oxidantes (espécies reativas de nitrogênio, ERNs) são elevados no organismo durante o exercício físico.
Contudo, como existem poucos estudos sobre os efeitos do exercício físico na formação de ERNs, o mesmo não será mais comentado neste trabalho.
Pode-se dizer, portanto, que a atividade física intensa pode aumentar a formação intracelular de EROs e promover estresse oxidativo.
Contudo, existem poucos trabalhos com humanos sobre esse problema porque muitos procedimentos disponíveis para quantificar lesões oxidativas em biomoléculas são invasivos e de difícil aplicação nos mesmos, principalmente os que envolvem biópsia muscular.
Em função disso, resolveu-se neste trabalho estudar em atletas envolvidos em diferentes atividades físicas intensas (jogo de futebol com 50min de duração, corredores de maratona, corredores de 400m rasos e treinamento de força/musculação com e sem suplementação com creatina) os efeitos agudos e crônicos do exercício físico na quimioluminescência urinária.
Em paralelo, jogadores de futebol foram submetidos à corrida em esteira rolante em que se quantificou, além da quimioluminescência urinária, a capacidade antioxidante plasmática total e concentração de malondialdeído (MDA).
Como será explicado abaixo, tanto a quimioluminescência urinária como o MDA plasmático são considerados indicadores de lesões oxidativas em lipídeos corporais (peroxidação lipídica).
Os estudos realizados foram aprovados pelo comitê de ética do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo e todos consentiram por escrito a realização dos procedimentos experimentais (esforço físico empreendido, coletas de amostras, etc.).
Realçamos que os atletas participantes dos experimentos neste trabalho não são fumantes ou consumidores de drogas proibidas pelo Comitê Olímpico Internacional.
Esse fato foi verificado através de consulta pessoal aos atletas.
Quimioluminescência urinária A ação oxidativa de EROs sobre lipídeos, principalmente sobre os de membranas biológicas, promove formação de hidroperóxidos que podem ser ciclizados, gerando compostos heterocíclicos denominados dioxetanos.
Esses compostos podem sofrer clivagem térmica produzindo carbonilas em estado excitado (singlete ou triplete, dependendo dos substituintes no anel dioxetanônico).
O decaimento dessas carbonilas para o estado fundamental com a emissão dessa energia na forma de fótons é o principal fator responsável pela quimioluminescência observada na urina.
A intensidade luminescente é, portanto, proporcional à concentração de carbonilas excitadas e reflete a extensão do processo de peroxidação lipídica tecidual.
A urina foi coletada neste trabalho antes e após a realização do exercício; após o término da corrida na esteira rolante também foram efetuadas duas coletas: uma imediatamente após e outra após três horas.
A urina foi mantida congelada até a sua análise, sendo centrifugada a 10.
000g por 10min em temperatura ambiente posteriormente ao descongelamento.
As medidas foram realizadas usando 3mL de urina suplementada com 1mL de fosfato de sódio, 0,1M, no pH 6,2.
A creatinina foi medida por procedimento descrito por Heinegard e Tinderstrom(9) e seu valor utilizado para corrigir a diluição das amostras.
Uma medida prévia da absorbância da amostra de urina é necessária para evitar absorção luminosa excessiva que pode interferir na quantificação da luminescência.
Neste trabalho, sempre que a absorbância da amostra centrifugada apresentou valor superior a 0,3, foi diluída com água Milli Q até esse limite.
O método foi originalmente descrito por Lissi et al.e a intensidade luminescente foi medida em cintilador líquido.Malondialdeído (MDA) Aldeídos são freqüentemente produzidos quando lipoperóxidos são metabolizados por organismos aeróbios.Sua identificação fornece índice indireto de injúria oxidativa resultante de peroxidação lipídica.
O MDA é um dos aldeídos mais abundantes resultantes da peroxidação lipídica tecidual, principalmente de ácido araquidônico (20:4), eicosapentaenóico (20:5) e docosahexaenóico (22:6).
O procedimento adotado para a quantificação de MDA por fluorescência foi o de Yagi(11), em que se mede a concentração plasmáticade MDA através da excitação da amostra em 515nm e quantificação em 553nm.
A quantidade de MDA foi expressa em nmol por mL de plasma.
A sensibilidade do procedimento permite a utilização do volume de 50µL de amostras de sangue retirados do lóbulo da orelha.
Como essas medidas concorriam com a determinação do lactato em sangue obtido no mesmo local, optou-se por coleta de amostra em vaso sanguíneo na região cubital do antebraço, em que se retiraram, em cada coleta, aproximadamente 5,0mL de sangue, obtendo-se 1,0mL de plasma após centrifugação refrigerada.
Foram utilizados 0,5mL de plasma neste experimento e 0,5mL na dosagem da capacidade antioxidante plasmática total.
Capacidade antioxidante total A capacidade antioxidante plasmática foi determinada pelo método de Whitehead(12), utilizando técnica de quimioluminescência para medir a capacidade antioxidante de fluidos biológicos.
A emissão de luz ocorre quando o substrato quimioluminescente (luminol) é oxidado pelo H2O2 em reação catalisada por horseradish peroxidase.
As estabilidades e intensidades da luz emitida são elevadas pela adição de p-iodofenol; sua emissão contínua depende da produção constante de radicais livres intermediários derivados do p-iodofenol, luminol e O2.
Por essa razão, a emissão de luz é sensível aos antioxidantes presentes, mas pode ser restabelecida quando os mesmos são consumidos na reação.
Como a geração de radicais livres intermediários é constante, o período de supressão da luz é diretamente relacionado com a quantidade de antioxidante presente na amostra.
O ensaio é sensível para medir a capacidade antioxidante de amostras biológicas e é expressa relativamente ao ácido carboxílico 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman- 2 (trolox), análogo solúvel da vitamina E.
O resultado é expresso como equivalente de trolox por litro de amostra.
Exercício simulado de futebol e treinamento de força – O jogo de futebol envolveu dois grupos de 12 jogadores alunos de graduação da Escola de Educação Física e Esporte-USP, utilizando todo o espaço do campo, mas a coleta de amostras foi feita em somente 10 alunos.
A duração foi de 50min e o treinamento de força constou de arranco e arremesso; o objetivo durante todo o período de treinamento (três vezes por semana por três meses) foi o de elevar o valor da força máxima nos respectivos exercícios empregados.
Após duas semanas de aprendizado, o treinamento de força utilizou sempre carga próxima da máxima (80-90% de 1RM) com poucas repetições sem intervalo (6-8 séries com 3-6 repetições com 3-5min de intervalo entre as séries).
Treinamento de maratonistas e corredores de 400m rasos – Os atletas especialistas em maratona correram 20km (freqüência cardíaca de 180-185 batimentos por min) como parte de seu treinamento diário, que representa o período de preparação física geral em que o maior objetivo visado é o trabalho em grandes volumes de treinamento semanal.
O grupo de corredores de 400m rasos realizou uma sessão diária de treinamento com exercícios específicos para o desenvolvimento da potência anaeróbia (treino intervalado), correspondente ao também período de preparação física geral.
A parte principal do treinamento constou de uma sessão de 3 x 4 séries de 300m rasos, com pausas de 3min entre cada exercício e de 5min entre cada série.
O ritmo solicitado foi de 36- 38 segundos em cada exercício, sendo o exercício intervalado realizado em pista de atletismo com 400m e a corrida de 20km, no campus da Universidade de São Paulo.
Treino de musculação e suplementação com creatina – Dezoito alunos do curso de Educação Física da Faculdade de Santos foram divididos em dois grupos de nove, grupos A e B, que já possuíam experiência prática de aproximadamente um ano com exercícios tipicamente utilizados em academias de ginástica.
Os mesmos foram submetidos previamente ao treino de hipertrofia muscular em bateria de testes e entraram nas semanas um e dois de preparação.
Após esse período entraram nas semanas de treino de hipertrofia.
Utilizou-se na suplementação com creatina monoidratada (CrH2O) o protocolo de Volek et al.
Após testes de 1 RM, medidas antropométricas e as duas primeiras semanas preparatórias, os indivíduos consumiram 30g de CrH2O por dia, divididos em seis doses iguais de 5g, em intervalos de três e quatro horas, perfazendo um total de 30g diários na primeira semana de suplementação (30g/dia por 7 dias, 210g no total) ou placebo (maltodextrina), correspondente à terceira semana de treinamento.
Após o período de consumo inicial, os grupos receberam uma quantidade de manutenção de 5g/dia por 42 dias, 210g no total, correspondente às cinco últimas semanas de treinamento.
A CrH2O foi cedida pela Protech Systems do Brasil, enquanto que a substância placebo (maltodextrina) foi adquirida em um estabelecimento comercial do ramo de suplementos nutricionais.
As substâncias foram encapsuladas por Pedrosa & Delsin – Farmácia de Manipulação Ltda., CGC 00243338/0001-74.
Tanto a CrH2O como a maltodextrina foram igualmente acondicionadas em cápsulas contendo 0,5g para evitar que os participantes do estudo soubessem quem estaria ingerindo creatina.
Para esse experimento, o protocolo de treinamento utilizado foi o proposto por Souza Jr.
que foi aplicado durante oito semanas.
As duas primeiras semanas (fase A) foram utilizadas para ajustes neuromusculares dos voluntários e as seis semanas subseqüentes (fase B) visaram aumentar a resultante da força muscular máxima e massa muscular (hipertrofia).
A semana preparatória (fase A) consistiu de exercícios realizados com 50% de 1 RM, com pausas de 120 segundos entre os mesmos.
O treinamento de hipertrofia (fase B) consistiu de utilização de 80% da carga máxima, tomando como referência o teste de 1 RM, quatro séries de 8-10 repetições com 120 segundos de pausas entre as séries e de 120 segundos entre os exercícios para outro agrupamento muscular.
A suplementação com creatina e placebo teve início na terceira semana, juntamente com o início do treinamento de hipertrofia.
O protocolo de treinamento consistiu na divisão dos agrupamentos musculares e dos exercícios para os respectivos grupos, bem como os dias específicos de treino.
Nas duas primeiras semanas, os voluntários executaram três séries com 12 repetições em todos os exercícios propostos, com alteração apenas para os exercícios abdominais, que foram realizados duas vezes por semana com cinco séries de 20 repetições em cada série, e com 50% de 1RM.
Para mais detalhes sobre o procedimento de treinamento adotado neste experimento, consultar Souza Jr.
O estudo realizado na esteira rolante motorizada foi efetuado segundo protocolo desenvolvido especialmente para avaliar a capacidade anaeróbia máxima do atleta (Mart test = maximal anaerobic running test ).
A intensidade foi aumentada progressivamente conforme a capacidade do atleta em suportar o esforço físico imposto até próximo à exaustão, que ficou entre 25 e 30min.
Os atletas foram submetidos ao teste em esteira rolante com determinação paralela do consumo de O2, freqüência cardíaca, quociente respiratório e lactato sanguíneo.
As freqüências de coleta das amostras de sangue para dosagens de lactato e demais parâmetros encontram-se descritas nas tabelas 1 e 2.
O sangue para dosagem de lactato foi colhido do lóbulo da orelha esquerda, com auxílio de capilares heparinizados, que comportam 25µL de sangue.
As determinações plasmáticas de MDA e capacidade antioxidante foram realizadas em plasma obtido conforme descrito acima, de sangue colhido na região cubital do antebraço nos mesmos intervalos de tempo.
Para essas coletas utilizaram-se seringas descartáveis heparinizadas, com descarte de amostras hemolisadas.
Os resultados individuais foram comparados com o repouso.
Ou seja, os atletas foram o seu próprio controle para os parâmetros analisados.
| Lactato plasmático (mmol/L) | Quocienterespiratório | Tempo (min) de exercício |
|---|---|---|
| 0,89 ± 0,07 | 0,86 ± 0,06 | (repouso) |
| 2,24 ± 0,11 | 1,23 ± 0,09 | 03 |
| 2,54 ± 0,10 | 1,34 ± 0,09 | 06 |
| 3,02 ± 0,12 | 1,40 ± 0,08 | 09 |
| 5,45 ± 0,17 | 1,47 ± 0,07 | 12 |
| 9,79 ± 0,20 | 1,52 ± 0,08 | 23 |
| 9,90 ± 0,18 | 1,57 ± 0,09 | 26 |
Todos o resultados comparados com o repouso são significativamente maiores (p < 0,01). Os resultados estão expressos como média ± desvio-padrão.
| Quimioluminescênciaurinária (cpm/mg de creatinina) |
MDA |
Capacidade antioxidante plasmática (µmol de trolox – Eq/L) |
Tempo (min) de exercício |
|---|---|---|---|
| 910,0 ± 10,0 | 0,21 ± 0,012 | 483 ± 88 | (repouso) |
| 0,23 ± 0,013 | 470 ± 65 | 03 | |
| 0,28 ± 0,011* (  33%) |
465 ± 50 | 06 | |
| 0,19 ± 0,011 | 650 ± 90* (
34%) |
09 | |
0,16 ± 0,012* (
24%) |
655 ± 88* (
36%) |
12 | |
| 1,50 ± 0,009* (
714%) |
233 ± 12* (
52%) |
23 | |
| 895,8 ± 9 | 1,60 ± 0,013* (
761%) |
200 ± 14* (
59%) |
26 |
| 657,8 ± 8* (28%)
|
3h após |
* p < 0,01, comparado com o repouso. MDA = malondialdeído; cpm
= contagem por min. Os resultados estão expressos como média
± desvio-padrão.
aumento;
queda.
Foi utilizada esteira rolante motorizada especial para avaliar seres humanos modelo Quinton 65, Quinton Instruments, Seatle-WA; para o exame do lactato foi empregado o analisador automatizado (modelo 2300 stat plus, Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH).
O sistema de análise metabólica utilizado no estudo do quociente respiratório foi o Teen-100 – Aeroesport Inc., EUA, todos do Ladesp (Laboratório de Desempenho Esportivo do Departamento de Esporte da Universidade de São Paulo).
O fluorímetro empregado na análise de MDA e capacidade antioxidante plasmática total foi o Yellow Springs Model YSI 53 (Laboratório de Bioquímica do Departamento de Bioquímica, IQ-USP) e o contador de cintilação utilizado foi o sistema Tri-carb da Packard (do Departamento de Histologia, ICB-USP).
Todos os reagentes foram obtidos da Sigma e Merck.
A análise estatística utilizou o teste t de Student para médias não pareadas após análise de variância two way.
